Propagazione delle piante: suggerimenti per la propagazione delle radici avventizie

Propagazione delle piante: suggerimenti per la propagazione delle radici avventizie

Le piante hanno bisogno di radici per fornire supporto, cibo e acqua e come deposito per le risorse. Le radici delle piante sono complesse e si trovano in una varietà di forme. Le radici avventizie sono tra questi vari tipi di forme di radice, e senza dubbio potresti chiederti, cosa significa avventizio? La crescita avventizia delle radici si forma su steli, bulbi, cormi, rizomi o tuberi. Non fanno parte della tradizionale crescita delle radici e forniscono un mezzo per la diffusione di una pianta senza fare affidamento sui sistemi di radici sotterranee.

Cosa significa avventizio?

Le piante con radici avventizie hanno un vantaggio in più sulle piante con sistemi di radici tradizionali. La capacità di far germogliare radici da parti della pianta che non sono radici reali significa che la pianta può estendersi e propagarsi da diversi mezzi. Ciò aumenta le sue possibilità di sopravvivenza e capacità di crescere ed espandersi.

Alcuni esempi di apparati radicali avventizi potrebbero essere i gambi dell'edera, i rizomi della coda di cavallo a rapida diffusione o le radici che si formano dagli alberi di pioppo e collegano i boschetti. Lo scopo principale di tale crescita delle radici è aiutare a fornire ossigeno alla pianta. Questo è utile nelle aree soggette a inondazioni o dove i suoli sono poveri e inospitali.

Piante con radici avventizie

Esistono molti tipi di piante che utilizzano radici avventizie per migliorare le loro possibilità di crescita e sopravvivenza. Querce, cipressi e mangrovie sono alberi che utilizzano radici avventizie per stabilizzare un boschetto, propagarsi e condividere le risorse.

Il riso è una fonte di cibo di base che cresce e si diffonde attraverso radici avventizie rizome. Felci, muschio stellato e la già citata coda di cavallo diffusa da fusti sotterranei che germogliano radici avventizie.

La crescita accidentale delle radici è estremamente evidente nei fichi strangolatori, che producono questo tipo di radice come supporto. Queste radici possono finire più grandi dell'albero principale e abbracciare piante più grandi, abbracciandole per sostenere il fico mentre tende verso la luce. Allo stesso modo, il filodendro produce radici avventizie in ogni nodo, che lo aiutano a salire e raccogliere risorse.

Propagare radici avventizie

Le radici avventizie sono prodotte dalle cellule del germoglio. Questi si formano quando le cellule staminali o le gemme ascellari cambiano scopo e si dividono in tessuto radicale. La crescita accidentale delle radici è spesso stimolata da ambienti a bassa ossigeno o condizioni di alta etilene.

Gli steli avventizi forniscono un metodo importante per clonare e propagare varie piante. Poiché le radici sono già su questi steli, il processo è ancora più facile che radicare la crescita terminale. I bulbi sono un classico esempio di un organismo di stoccaggio costituito da tessuto staminale, che produce radici avventizie. Questi bulbi producono bulbi nel tempo, che possono essere separati dal bulbo genitore e avviati come nuove piante.

Altre piante con radici su fusti superficiali si propagano tagliando una sezione del fusto con una buona crescita delle radici appena sotto un nodo. Piantare l'area delle radici in un terreno fuori suolo, come la torba, e mantenerla moderatamente umida fino a quando le radici crescono e si diffondono.

La propagazione delle radici avventizie fornisce un metodo di clonazione più rapido rispetto alle talee, poiché le radici sono già presenti e non è necessario alcun ormone radicante.


Sfondo: Gli ibridi di larice (Larix kaempferi × Larix olgensis) sono importanti specie di rimboschimento nella Cina nord-orientale. Vengono regolarmente propagati tramite talee radicate. Nonostante l'importanza del radicamento, si sa poco sulla regolazione dello sviluppo accidentale delle radici negli ibridi di larice. La tecnologia 454 GS FLX Titanium rappresenta un nuovo metodo per caratterizzare i trascrittomi di specie non modello. Questo metodo può essere utilizzato per identificare geni espressi in modo differenziale, quindi è possibile eseguire analisi di elettroforesi su gel di differenza bidimensionale (2D-DIGE) e spettrometria di massa a tempo di volo di desorbimento-ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF / TOF MS). utilizzato per analizzare le proteine ​​corrispondenti. In questo studio, abbiamo analizzato talee semi-lignificate di due cloni di L. kaempferi × L. olgensis con diverse capacità di radicamento per studiare le basi molecolari dello sviluppo accidentale delle radici.

Risultati: Abbiamo analizzato due cloni clone 25-5, con forte capacità di rooting, e clone 23-12, con scarsa capacità di rooting. Abbiamo costruito quattro librerie di cDNA da 25-5 e 23-12 in due fasi di sviluppo. Il sequenziamento è stato condotto utilizzando la piattaforma di pirosequenziamento 454. È stato prodotto un totale di 957832 letture grezze, il 95,07% erano letture di alta qualità e sono state assemblate in 45137 contig e 61647 singleton. Le funzioni degli unigeni, come indicato dalla loro annotazione Gene Ontology, includevano diversi ruoli nelle funzioni molecolari, nei processi biologici e nelle categorie di componenti cellulari. Abbiamo analizzato 75 punti proteici (-fold change ≥ 2, P ≤ 0,05) da 2D-DIGE e identificato le proteine ​​differenzialmente espresse utilizzando MALDI-TOF / TOF MS. Un'analisi congiunta del trascrittoma e del proteoma ha mostrato che geni correlati a due percorsi, la sintesi della poliammina e la risposta allo stress, potrebbero svolgere un ruolo importante sullo sviluppo delle radici avventizie.

Conclusioni: Questi risultati forniscono informazioni fondamentali e importanti per la ricerca sul meccanismo molecolare dello sviluppo accidentale delle radici. Abbiamo anche dimostrato per la prima volta l'uso combinato di due importanti tecnologie come un potente approccio per far avanzare la ricerca su specie di larice non modello, ma per il resto importanti.


La crescita sana delle radici è essenziale per l'assorbimento di nutrienti e acqua. Tra i macronutrienti azoto, fosforo e potassio - N-P-K - il fosforo assicura una buona crescita delle radici. Aiuta anche nella produzione di frutta. Il fosforo è così importante che le formule alimentari a base di pomodoro in genere contengono più fosforo dell'azoto e del potassio. A complemento del lavoro del fosforo, l'azoto garantisce una crescita vegetativa verde e il potassio aumenta il vigore della pianta, la resistenza alle malattie e il sapore. I rapporti N-P-K dovrebbero approssimarsi a 8-32-16.

Incoraggia un vigoroso apparato radicale. Quando acquisti piante di pomodoro da trapiantare, scegli piante alte e con le gambe lunghe. Spoglia tutte le foglie tranne la parte superiore dallo stelo e pianta lo stelo in modo che solo la parte superiore delle foglie rimanga appena sopra il livello del suolo. Se necessario, posiziona lo stelo in diagonale nel foro. Dall'intero stelo sotterraneo si svilupperà un ampio apparato radicale che stimolerà la crescita e trascinerà i tuoi pomodori durante l'estate peggiore.

Pianta i pomodori abbastanza distanti tra loro da non ombreggiare l'un l'altro. I fertilizzanti naturali o organici rilasciano sostanze nutritive per un lungo periodo di tempo e non devono essere applicati così spesso come fertilizzanti sintetici. È anche meno probabile che brucino radici di pomodoro tenere. Mentre i pomodori amano il calore del sole, le loro radici non dovrebbero essere lasciate seccare. Proteggili dal sole e dal vento con uno o due pollici di pacciame.


Discussione

La formazione di AR richiede l'inizio di nuove cellule fondatrici dal cambio interfascicolare adiacente ai tessuti vascolari

La formazione di AR è cruciale per la propagazione commerciale e, a seconda della specie, ci sono due meccanismi per la formazione di AR nella maggior parte delle piante legnose. Le cellule fondatrici di AR possono (1) iniziare nello stelo ma rimanere dormienti fino all'induzione della formazione di AR da parte delle condizioni ambientali 5 o (2) iniziare de novo da cellule, come il floema o le cellule del parenchima dello xilema, all'interno o adiacenti ai tessuti vascolari, come le cellule del cambio interfascicolare o della giunzione floema / cambio 3,5,23. Un tipico gambo di mela contiene fasci vascolari collaterali con un anello attorno al midollo (Fig. 1 e 2, Fig. S1). Inizialmente (a 0 h), le cellule sottostanti le lenticelle nel cambio interfascicolare adiacente ai tessuti vascolari non avevano alcuna attività meristematica osservabile, mentre le cellule fondatrici avevano già subito numerose divisioni cellulari 72-168 h dopo il taglio (Fig. 2 e S2) . Pertanto, la formazione di AR nelle talee M.9 del portinnesto di mele avviene tramite il secondo meccanismo. Ciò è coerente con i risultati riportati di recente in specie di alberi forestali, in particolare conifere, in cui le radici sono indotte da cellule determinate o differenziate e più lontano da posizioni in cui le radici non si trovano normalmente durante lo sviluppo 24.

Gli AR sporgono attraverso le lenticelle

La formazione di lenticelle culmina con la disintegrazione delle cellule di sughero sotto il cambio di sughero, queste cellule di sughero vengono infine sostituite da cellule a pareti sottili disposte in modo lasco, chiamate anche cellule supplementari o cellule di riempimento, durante la formazione iniziale dello strato di sughero. Successivamente, l'epidermide e il sughero vengono schiacciati fino a rompersi mentre le cellule supplementari continuano a dividersi e alla fine si dividono in una serie di proiezioni labiali, che costituiscono lenticelle 25. I tessuti all'interno delle lenticelle forniscono un canale naturale non solo per lo scambio di gas durante inondazioni o altri stress abiotici, ma anche per la formazione e la crescita di AR. In questo studio, le lenticelle delle talee hanno mostrato una crepa sempre più grande durante la fase iniziale della formazione di AR (Fig. 1a – g). I nostri risultati hanno mostrato che, in ogni momento durante lo sviluppo AR, le lenticelle di controllo e le talee trattate con IAA erano più gravemente rotte dalla divisione cellulare fondatrice rispetto a quelle delle talee trattate con NPA (Fig. 1h-u). Questi cambiamenti evolutivi indicano che l'auxina promuove la deiscenza lenticel e la protrusione AR dai canali lenticel. Questo processo è simile alla formazione del canale mediata da auxina per l'emergenza di LR in A. thaliana 26,27. In entrambi i casi, l'assorbimento di auxina nelle cellule corticali e nelle cellule epidermiche sovrastanti il ​​primordio LR durante l'emergenza determina una maggiore espressione di geni che codificano per enzimi di rimodellamento della parete cellulare, come la pectato liasi, per promuovere la separazione cellulare per l'emergenza LR 26,27. Inoltre, le osservazioni istologiche hanno rivelato canali intrastem formati da cavità allargate nel cambio interfascicolare e il numero e le dimensioni di queste cavità sono aumentate nel tempo (Fig. 2). Questi risultati suggeriscono inoltre che le cellule situate di fronte alle cellule fondatrici di nuova formazione potrebbero aver subito la morte cellulare programmata (PCD) per consentire lo sviluppo del primordio AR, supportando la conclusione di un precedente studio sulla formazione di AR nel pomodoro 28.

Fase di induzione della formazione di AR nelle talee di mele

La formazione di AR nelle talee di mele può essere suddivisa in tre fasi basate sui cambiamenti cellulari caratteristici come descritto nelle osservazioni anatomiche: induzione (0–72 ore), iniziazione (72–120 ore) ed estensione (120–168 ore). Nel controllo e nelle talee trattate con IAA, la fase di induzione a 72 h è stata caratterizzata da un aumento del numero di cellule fondatrici con citoplasma denso e nuclei di deglutizione (Fig. 2g, h), nonché dall'idrolisi dei grani di amido (Fig. 3p, q), che presumibilmente ha fornito energia per l'ulteriore divisione e allungamento delle cellule fondatrici AR. Al contrario, un gran numero di granuli di amido è rimasto nei cloroplasti a 72 h nelle talee di mele trattate con NPA (Fig. 4j), suggerendo che l'NPA ha inibito l'idrolisi dell'amido durante la formazione di AR, mentre l'IAA ha migliorato la conversione dell'amido in "energia di cassa" per l'induzione AR. Questi risultati suggeriscono che l'IAA modula l'induzione dell'AR inducendo la dedifferenziazione delle cellule cambiali interfascicolari nelle cellule fondatrici dell'AR.

Pertanto, l'inizio dell'AR inizia con la divisione e l'allungamento di un gran numero di cellule fondatrici raggruppate che riempivano la cavità aperta dalla scissione della lenticella nel controllo e nelle talee trattate con IAA (Figg. 2m, ne 3f – n), mentre la divisione cellulare del fondatore era gravemente compromessa nelle talee di mele trattate con NPA (Fig. 2l). Inoltre, il trattamento IAA ha aumentato significativamente il rapporto tra le cellule fondatrici divise e il numero totale di cellule parenchimali e la densità delle cellule fondatrici è aumentata più rapidamente in queste talee rispetto ai controlli (Fig. 3a). Questi dati dimostrano l'effetto di promozione dell'IAA sulla divisione delle cellule fondatrici primordiali all'induzione della formazione di AR (Fig. 3a).

Con l'allungamento delle cellule fondatrici, la formazione di AR progredisce fino alla fase di estensione quando la percentuale di cellule allungate rispetto al numero di cellule fondatrici divise aumenta (Fig. 4p, q, s, t). Le cellule fondatrici di AR allungate si sono verificate in precedenza nelle talee trattate con IAA ed erano quasi il doppio di quelle nelle talee di controllo (Fig. 3b). Pertanto, ipotizziamo che sia la deiscenza lenticella che la PCD 28 intrastem possano regolare la formazione di AR modulando PAT, che regola il gradiente di auxina.

L'esaurimento dei chicchi di amido è associato all'inizio dell'AR

Studi precedenti hanno scoperto che il mantenimento di un livello e di un gradiente di auxina appropriati nella porzione basale dei germogli è essenziale per la formazione di AR 17,29,30, ma l'esatto meccanismo alla base di questo fenomeno non è ancora chiaro. Qui, abbiamo osservato un rapido esaurimento dei chicchi di amido all'avvio della formazione di AR nelle talee di mele. È stato proposto che l'accumulo e l'esaurimento dell'amido possano essere un indicatore biochimico della formazione iniziale delle radici nelle talee ipocotiliche, che fornisce energia per la formazione di AR 31. Questo processo di integrazione energetica è regolato positivamente dall'auxina 32,33,34. In accordo con i dati pubblicati, i risultati dei nostri studi di analisi spaziale e temporale supportano anche un ruolo chiave dell'accumulo e della degradazione dei chicchi di amido nella formazione di AR nelle piante legnose, con IAA che esercita un effetto stimolante sulla formazione di AR e NPA che ritarda questo processo (Fig. . 4). Inoltre, l'esaurimento dei chicchi di amido è stato anche associato alla proliferazione e alla riorganizzazione delle endomembrane (Fig. 4 e S4). Sebbene sia nota la base fisiologica di come questi due processi si relazionano alla formazione di AR, il fatto che l'esaurimento dei cereali e la formazione di un nuovo sistema di membrane siano stati promossi dall'IAA e inibiti dall'NPA suggerisce che PAT è la forza trainante iniziale di questi processi 35.

Ruoli di auxina e citochinina durante la formazione di AR

Studi recenti hanno dimostrato che ZT può sopprimere la formazione di primordio AR, mentre la segnalazione auxina regola positivamente questo complesso processo biologico, suggerendo che livelli relativamente alti di IAA e ZT bassi sono prerequisiti per l'induzione e l'inizio di AR 36,37. Le citochinine e l'auxina sembrano esercitare effetti opposti sulla formazione di AR 4,38. Inoltre, l'auxina può sottoregolare direttamente la biosintesi delle citochinine, mentre le citochinine hanno scarso effetto sulla biosintesi dell'auxina 39. Gli alti livelli iniziali di auxina nelle talee durante le fasi di induzione e inizio della formazione di AR sono stati sostituiti da alti livelli di citochinine durante la fase di estensione, suggerendo che si verifica un crosstalk tra auxina e metabolismo delle citochinine, sebbene la base molecolare rimanga da caratterizzare.

L'auxina sembra regolare la formazione di AR principalmente modulando la divisione e l'allungamento delle cellule fondatrici dell'AR durante le fasi di induzione e iniziazione (Fig. 2 e 3). Simile a quello osservato per la formazione LR in A. thaliana 40, i livelli di IAA nelle talee di mele hanno continuato ad aumentare durante le fasi di induzione (0-72 ore) e iniziazione (72-120 ore), con un picco a 120 ore, seguito da una riduzione costante dopo l'ingresso nella fase di allungamento (120-168 ore) . I livelli di ZT sono aumentati anche durante le fasi di induzione e iniziazione e hanno raggiunto il picco a 96 ore prima che iniziassero a diminuire. Al contrario, l'NPA ha ridotto l'accumulo di IAA ma ha avuto scarso effetto sui livelli di ZT. Questi risultati indicano il mantenimento dell'omeostasi di auxina e citochinina tramite la regolazione del feedback. Recenti studi che monitorano le funzioni tra auxina e citochinina durante il processo di radicazione del taglio della mela hanno mostrato che il rapporto tra auxina e citochinina è aumentato anche durante la fase di induzione AR, il che può essere dovuto al verificarsi della programmazione cellulare e alla necessità di divisione cellulare 36. Ulteriori dati molecolari hanno supportato che le alterazioni nei livelli di CTK possono funzionare come feedback nella regolazione dell'espressione di geni correlati all'auxina come SHY2 e PIN1 36 .

Correlazioni tra MdPIN espressione e formazione AR

Maggior parte PINLa funzione di s nel trasporto di auxina direzionale mentre mostra modelli di espressione differenziale, riflettendo il loro potenziale ruolo multiforme nello sviluppo della pianta 41,42,43. In Arabidopsis, i membri del PIN la famiglia genica partecipa alla PAT vascolare, alla modellazione delle radici, al gravitropismo delle radici, alla creazione del gradiente auxina guidato dal sink e alla polarità apicale-basale 44,45,46,47,48,49. Il PIN family in apple comprende otto membri, tutti espressi in modo differenziale durante la formazione AR (Fig. 6). Pertanto, abbiamo proposto un possibile modello del meccanismo di regolazione per mappare la funzione principale di ciascuno MdPIN durante la radicazione delle talee (Fig. 7a).

un Espressione differenziale di MdPINs durante l'induzione, l'inizio e l'estensione dell'AR. Le linee tratteggiate rappresentano i punti temporali di 24 ore. MdPIN8 l'espressione ha raggiunto il picco durante la fase di induzione (24 h), indicando che MdPIN8 può svolgere un ruolo importante nella fase iniziale dell'induzione della realtà aumentata. MdPIN10 l'espressione ha raggiunto il picco a 48 ore ed è stata per lo più bassa negli altri punti temporali, suggerendo questo MdPIN10 contribuisce anche all'induzione e all'avvio di RA. La massima espressione di MdPIN1, MdPIN3, MdPIN4, e MdPIN5 si è verificato a 96 ore, appena 24 ore prima dei cambiamenti morfologici nella fase di inizio, che si è conclusa a 120 ore. Ulteriore, MdPIN1, MdPIN2, MdPIN4, e MdPIN5 l'espressione è rimasta alta a 120 ore, indicando che tutti questi geni funzionano anche durante la fase avanzata dell'iniziazione. MdPIN7 l'espressione ha raggiunto il picco a 120 ore, suggerendo che MdPIN7 funziona principalmente durante la fase avanzata dell'iniziazione. A 168 h, il differenziale aumenta di MdPIN4, MdPIN5, e MdPIN8 sono state osservate espressioni, suggerendo che questi membri promuovono la deiscenza lenticella e la protrusione AR dall'epidermide durante la fase di estensione. b Modello proposto dei meccanismi di regolazione cellulare durante le fasi di formazione dell'AR. Reticolo endoplasmatico ER, trasporto auxina polare PAT, morte cellulare programmata PCD. Le frecce rappresentano elementi normativi positivi. Le linee che terminano con una barra rappresentano elementi normativi negativi.

Upregulation di MdPIN8 e MdPIN10 era principalmente associato all'induzione dell'AR. La fase di iniziazione AR sembra associata a una sovraregolazione di MdPIN1, MdPIN4, MdPIN5, MdPIN8, e MdPIN10 MdPIN3 era sovraregolato nella fase iniziale dell'iniziazione, mentre MdPIN2 e MdPIN7 sono stati sovraregolati verso la fine della fase di iniziazione (Fig. 7a). La fase di estensione è principalmente associata alla sovraregolazione di MdPIN4, MdPIN5, e MdPIN8 (Fig. 7a). I nostri dati suggeriscono che sia diverso MdPINÈ probabile che partecipino alle diverse fasi del processo di formazione dell'AR in un modo unico, ad esempio, i loro prodotti genici possono regolare direttamente o indirettamente la formazione dell'AR in modo cooperativo mediando i cambiamenti anatomici e fisiologici nelle talee (Fig. 7b). Futuri studi biochimici dovrebbero concentrarsi sui diversi modelli di espressione di MdPIN proteine ​​e impiegano test di ibridazione in situ per indagare ulteriormente la funzione di ciascuna nella regolazione di questo processo di radicazione postembrionale.


Materiali e metodi

Materiale vegetale e condizioni di crescita

Talee testate contro il virus della patata dolce "Georgia Jet"Cultivar contenente tre nodi (numeri di nodo 7–9 dall'apice del germoglio Ma et al., 2015) sono state ottenute dalla regione di Hasharon, Israele. Le talee sono state piantate in vasi di PVC (dimensioni: diametro, 10 cm di lunghezza, 30 cm), pre-riempiti con sabbia lavata. Le foglie del nodo 9 sono state rimosse con cura e quindi il nodo 9 è stato immerso nella sabbia. Le piante sono state autorizzate a crescere in una serra presso il Volcani Center, Rishon LeZion, Israele, nel mese di maggio 2017 a condizioni di temperatura di 25/20 ° C ± 3 temperature giorno / notte. Durante l'intero esperimento, le piante sono state coltivate in condizioni naturali senza richiedere luce supplementare. Le piante sono state inumidite a metà della capacità del campo con acqua (100 ml) ogni tre giorni, fino a 2 W dopo la semina. Successivamente, una soluzione fertilizzante a basso contenuto di azoto (100 mg L –1 di 20:20:20 N: P: K) è stata somministrata due volte a settimana, fino alla fine dell'esperimento. Il campionamento è stato effettuato in tre momenti: 1W, 2W e 5W dopo la semina utilizzando un minimo di 18 piante in ogni momento. Questi punti temporali sono stati considerati in base al comportamento di sviluppo della radice (i) 2W è il momento in cui le radici si sviluppano in radici lignificate o SR (Villordon et al., 2009), mentre (ii) a 5W è comparsa la formazione di SR. In ogni momento, l'intero apparato radicale, originato dal nodo 9, è stato raccolto da ciascuna delle 18 piante campionate. Dopo la raccolta, le radici sono state classificate in due parti: (i) prossimale (P 0–3 cm vicino allo stelo) e (ii) distale (D 3–10 cm dallo stelo Figura 1). Le radici campionate, di entrambe le categorie (P e D), sono state utilizzate per analizzare i parametri dell'architettura del sistema radicale (RSA), l'anatomia delle radici, i livelli di amido e l'espressione genica come descritto di seguito, consentendo confronti tra le parti P e D, a livello fisiologico e molecolare livelli. La configurazione sperimentale è descritta nella Figura supplementare 1.

Figura 1. Parti prossimali e distali dello Sweetpotato "Georgia Jet"Radice avventizia durante lo sviluppo. L'architettura del sistema di root viene presentata come registrata in una fase iniziale di sviluppo delle radici (2 settimane dopo la semina UN) e 5 settimane dopo la semina, quando è evidente lo sviluppo di una radice di immagazzinamento (B). Le parti della radice prossimale (P) e distale (D) rappresentano rispettivamente 0–3 cm e 3–10 cm, misurate dallo stelo. Barra della scala = 3 cm.

Analisi del sistema di root

L'imaging digitale è stato eseguito per l'intero sistema radicale campionato a 2W e 5W dopo la semina come indicato sopra, utilizzando sei piante per tempo di campionamento (Figura 1 supplementare). Le immagini sono state esaminate utilizzando il software ImageJ (ImageJ 1.51a, NIH, Stati Uniti Schneider et al., 2012), esaminando separatamente le parti P e D della radice. I parametri RSA misurati includevano quanto segue: numero di radice laterale (LR) e lunghezza LR per pianta e densità LR per AR (numero LR diviso per la rispettiva lunghezza AR 3 e 7 cm, rispettivamente per le parti P e D).

Analisi istochimica e imaging con autofluorescenza

I campioni di radice sono stati prelevati da sei a otto piante a 1W, 2W e 5W dopo la semina, dove i campioni da 5W includono sia SR che non SR lignificati. In ogni punto temporale (1W, 2W e 5W) e tipo di radice (SR e non SR lignificati) le parti di radice P e D sono state raccolte separatamente (Figura supplementare 1). Tutti i campioni di radice sono stati conservati in una soluzione FAA fino all'analisi. La composizione di 1 L di soluzione FAA era di formaldeide al 35% (100 ml), acido acetico glaciale (50 ml), etanolo al 96% (520 ml) e dH2O (330 ml).

L'analisi istochimica e l'imaging con autofluorescenza sono state eseguite come descritto da Singh et al. (2019). I campioni sono stati prima disidratati utilizzando serie di diluizioni di etanolo, quindi incorporati in paraffina per il loro sezionamento utilizzando un microtomo (Ruzin, 1999). Le sezioni di radice con uno spessore di 15 μm sono state preparate utilizzando il microtomo (Leica RM2245, Leica Biosystems, Nussloch, Germania). Le sezioni di radice sono state deparafinizzate utilizzando una soluzione istocleare e quindi reidratate con serie di diluizioni di etanolo. Queste sezioni di radice elaborate sono state utilizzate per la colorazione istochimica e l'imaging con autofluorescenza. La colorazione istochimica è stata eseguita utilizzando la colorazione verde safranina rapida o fluoroglucinolo-HCl (Ph-HCl o Weisner) per osservare il sistema vascolare della radice e la deposizione di lignina come dettagliato da Singh et al. (2019). La colorazione con floroglucinolo-HCl è stata eseguita secondo Mitra e Loque (2014). L'esame microscopico delle sezioni è stato eseguito utilizzando un microscopio ottico (Leica, Germania) e le immagini sono state scattate da una fotocamera digitale Nikon DS-Fi1. L'imaging con autofluorescenza è stato eseguito utilizzando la microscopia confocale per sezioni non colorate e deparaffinate (Donaldson e Knox, 2012). Tutte le osservazioni microscopiche e le acquisizioni di immagini sono state eseguite da un microscopio a scansione laser Leica SP8 (Leica, Wetzlar, Germania), costituito da un laser a stato solido con luce a 405 nm, utilizzando il software Leica Application Suite X (LASX, Leica, Wetzlar, Germania).

Le immagini acquisite dopo l'analisi istochimica sono state utilizzate per analizzare i parametri vascolari delle radici. I vasi xilematici totali sono stati determinati contando il numero di protoxylem, metaxylem e xilem secondario. Il software ImageJ (ImageJ 1.51a, NIH, United States Schneider et al., 2012) è stato utilizzato per analizzare / calcolare i seguenti parametri: area radicolare totale, area occupata da elementi xilematici (vasi e fibre) e area radicolare percentuale coperta da xilema vasi costituiti da protoxilema, metaxilema e xilema secondario.

Analisi dell'amido

Le radici sono state campionate da 18 piante in ogni momento, 1W, 2W e 5W dopo la semina. Le parti di radice P e D per questi campioni sono state raccolte separatamente (Figura supplementare 1). Il campione totale di 250 mg di radice è stato macinato in una potenza fine e il contenuto di amido è stato determinato dal protocollo stabilito (Singh et al., 2019). Il glucosio (0,04%) è stato utilizzato come standard.

Estrazione dell'RNA e analisi dell'espressione genica

Le radici sono state campionate da 18 piante in ogni punto temporale, 1W, 2W e 5W dopo la semina, raccogliendo le parti P e D separatamente (Figura 1 supplementare). I campioni di radice sono stati conservati immediatamente a -80 ° C fino all'analisi. L'estrazione dell'RNA totale e la preparazione del cDNA sono state eseguite utilizzando rispettivamente RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germania) e Verso cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Lituania). L'analisi quantitativa della trascrittasi inversa-PCR (qRT-PCR) per esaminare l'espressione genica è stata eseguita in una miscela di reazione (10 μl) contenente cDNA, primer forward e reverse e ABsolute Blue qPCR SYBR Green ROX Mix (Thermo Fisher Scientific, Lituania), utilizzando un sistema Rotor Gene 6000 Real-Time PCR (Corbett Life Science, Australia). Le condizioni di reazione sono state fissate a 95 ° C per 10 secondi, 60 ° C per 15 secondi e 72 ° C per 20 secondi, con 40 cicli. I risultati sono stati analizzati dal software del gene Rotor e l'espressione relativa dei geni è stata calcolata con il metodo 2 –ΔCt o 2 –ΔΔCt utilizzando la fosfolipasi D1a (PLD) come gene di riferimento. I primer sono stati progettati utilizzando Primer3Plus 1 (Tabella supplementare 1). La mappa termica è stata preparata da MultiExperiment Viewer, software MeV v4.9 2, utilizzando i profili di espressione ottenuti con il metodo 2 –ΔΔCt. Il raggruppamento gerarchico dei geni era basato sulla correlazione di Pearson, che consente il raggruppamento dei geni in base al modello e ai livelli di espressione.

Analisi statistica

L'analisi statistica dei dati è stata eseguita da Student's t-test a P ≤ 0,05, utilizzando il software statistico JMP 5.0.1a (SAS Institute Inc., NC, Stati Uniti).


Radice avventizia

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3. Radici avventizie che svolgono altre funzioni specializzate

A) Radici riproduttive

In alcune piante, le radici avventizie possono essere utilizzate nella propagazione vegetativa delle piante. Tali radici portano gemme avventizie che possono dare origine a nuove piante quando le condizioni sono favorevoli.

Esempi: patata dolce, dalia

B) Radici assimilatorie

Le radici modificate per eseguire la fotosintesi sono chiamate radici assimilatorie. Sono radici verdi che sono spesso molto ramificate per aumentare l'area fotosintetica.

Esempi: Castagna d'acqua, Tinospora

C) Radici saprofitiche

Le radici avventizie saprofite sono associate a ife fungine, sia ectomicorrize che endomicorrize. Tali piante di solito crescono nell'humus quando le radici sono infestate da miceli fungini, che formano un mantello sulla radice. Il micelio aiuta l'assorbimento delle soluzioni alimentari dal terreno che viene utilizzato sia dalla pianta ospite che dal fungo micorrizico. Le radici in tali piante sono generalmente sottosviluppate. Le punte smettono di crescere e i peli delle radici sono per lo più assenti.

Esempi: Sarcode, Monotropa

D) Radici parassitarie / haustoriali

Alcune piante vivono su altre piante per i loro nutrienti e l'approvvigionamento idrico. Le radici delle piante parassite penetrano negli steli o nelle radici della pianta ospite, solo fino allo xilema o addirittura fino al floema, per assorbire l'acqua, i minerali e il cibo organico necessari.

E) Radici epifite

Come suggerisce il nome, le radici epifite si trovano su epifite o piante che crescono su altre piante. In tali piante, le radici sono igroscopiche e pendono liberamente nell'aria. Hanno un tessuto epidermico modificato chiamato velamen che svolge la funzione specializzata di assorbire l'umidità dall'aria. Alcune di queste radici sono anche verdastre per la presenza di clorofilla e svolgono l'assimilazione del carbonio.

Esempi: Dendrobium, Venda

F) Spine di radice

In alcune piante, le radici avventizie vengono modificate per formare spine dure e appuntite. Tali radici potrebbero funzionare per difendere la pianta dall'essere sradicata dagli animali.


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